IVES Technical Reviews, viña & vinoQuitosanos y enfermedades de la madera de la vid: estudios en el laboratorio y el viñedo, resultados sorprendentes1 BIOLAFFORT, 11 rue Aristide Bergès, F-33270 Floirac2 INRAE, Université de Bordeaux, ISVV, Bordeaux Sciences Agro, UMR SAVE, 71 avenue Edouard Bourleaux, BP81, F-33883 Villenave d’Ornon3 ALMAVITIS, 11 rue Aristide Bergès, F-33270 FloiracMayetValérie1LecomtePascal2NazarisBastien1BadetLucile3MoineCharlotteGourraud1etVirginie1*valeriem09.cook@gmail.fr; pascal.lecomte210@orange.fr; virginie.moine@laffort.comAbstract
Se estudió el potencial de los quitosanos para luchar contra las enfermedades de la madera de la vid (EMV) gracias a una colaboración público-privada. Se realizaron pruebas in vitro, ensayos de eficacia en el viñedo y análisis de laboratorio para entender sus mecanismos de acción. In vitro, los quitosanos de bajo peso molecular (PM), los más solubles, fueron a menudo los más eficaces. En el viñedo, los más eficientes fueron los de PM medio, en particular los clorhidratos de quitosano que forman una película protectora. Estos podrían ser explotados como apósitos para las heridas de poda, de poda drástica o de limpieza.
El quitosano es un producto natural extraído de la quitina de la pared de los hongos o de los caparazones de crustáceos e insectos. Es utilizado en numerosas áreas (medicina, tratamiento de aguas residuales, cosmética...) incluyendo la enología1. En protección de cultivos, el quitosano es también conocido por sus propiedades antivirales, antibacterianas, antifúngicas y por contribuir a las defensas naturales de las plantas2. No obstante, su mecanismo de acción en la lucha directa frente a los bioagresores de las plantas sigue siendo poco conocido. En las vides, el quitosano de origen fúngico es una sustancia de base aprobada como elicitor de los mecanismos de defensa de la planta. Con el fin de comprender mejor la variabilidad en la eficacia de los quitosanos e identificar el mejor candidato para uso en vides, se emprendió un estudio en colaboración desde el 2016. Así, se evaluaron 23 quitosanos, pero solo 16 fueron objeto de varias pruebas, es decir: 7 quitosanos extraídos de crustáceos (OCe3, Ce20, Ca50, J80, S674 y dos clorhidratos de quitosano, el HA y el HS), 5 de hongos (OF3, Fda30, LF43, F329 y el clorhidrato de quitosano H90) y 4 de insectos (OY5, Y40, Y350 e Y903). Las letras identifican los quitosanos, las cifras indican su PM (kDa) cuando es conocido.
In vitro : los menos pesados, ¡los más eficaces!
Se evaluó primero en el laboratorio la capacidad de los quitosanos para inhibir el crecimiento micelial de dos hongos patógenos implicados en las enfermedades de la madera (Eutypa lata o eutipiosis, y Phaeomoniella chlamydospora o yesca). Como solo los oligoquitosanos y los clorhidratos son solubles en el agua, se ideó un método original (Figura 1).
Figura 1. Ilustración del método original utilizado para evaluar los quitosanos. Se deposita una alícuota de 300µL al centro y en la superficie de un medio de agar en placa de Petri. Después del secado, se deposita una pastilla de micelio al centro del círculo que contiene el producto. Se calcula la eficacia midiendo el diámetro de la colonia micelial y comparándola con aquella de un control no tratado.
Figura 1. Ilustración del método original utilizado para evaluar los quitosanos. Se deposita una alícuota de 300µL al centro y en la superficie de un medio de agar en placa de Petri. Después del secado, se deposita una pastilla de micelio al centro del círculo que contiene el producto. Se calcula la eficacia midiendo el diámetro de la colonia micelial y comparándola con aquella de un control no tratado.
Para las 3 concentraciones evaluadas (0,05, 0,2 y 1 %), los quitosanos S674, F329, Y350 e Y903, de fuerte PM (> 300 kDa), mostraron sistemáticamente los menores niveles de eficacia, sea cual fuere el agente patógeno. Por el contrario, los mejores porcentajes de eficacia fueron observados con los oligoquitosanos (PM más bajos, ≤ a 5 kDa). El origen del quitosano (fúngico, crustáceo o insecto) no parece ejercer influencia sobre los niveles de eficacia. De esta manera, los mejores candidatos contra estos dos hongos patógenos fueron los oligoquitosanos, así como los quitosanos de PM medio (comprendido entre 5 y 130 kDa) (Tabla 1).
Tabla 1. Efecto de los quitosanos de diferentes orígenes, probados in vitro a dosis de 1 % sobre el crecimiento micelial de E. lata y de P. chlamydospora. En la mayoría de los casos los productos fueron testeados dos o tres veces.
titre du tableau
Quitosanos
Eficacia (%)
E. lata
P. chlamydospora
Crustáceo
OCe3
100 ± 0
57 ± 18
Ce20
91
75
Ca50
85 ± 3
78 ± 3
J80
35
46
HA*
92 ± 1
46 ± 22
HS*
90 ± 3
43 ± 7
S674
0 ± 0
3 ± 4
Fúngico
OF3
100 ± 0
59 ± 11
Fda30
87
41
LF43
87 ± 5
69 ± 24
H90
86 ± 6
45 ± 24
F329
4 ± 6
5 ± 7
Insecto
OY5
92 ± 1
74 ± 17
Y40
90 ± 1
62 ± 28
Y350
2 ± 3
0 ± 0
Y903
2 ± 3
18 ± 6
*PM desconocido
En el viñedo: los menos pesados, ¡¿los menos eficaces?!
Desde el 2016, las pruebas en el viñedo permitieron evaluar la aptitud del quitosano para proteger las heridas de poda frente a enfermedades de la madera, según el método oficial CEB n°15534, basado en infecciones artificiales. La eficacia es evaluada según las tasas de infección de las heridas (30 sarmientos por producto) y las cantidades de ramillas de madera infectadas por la herida (25 ramillas analizadas por sarmiento)
El LF43 (fúngico) fue el primero probado en el viñedo, frente a E. lata (2016, 2017)y P. chlamydospora (2017). Aplicado en preventivo como pintura sobre las heridas de poda en una dosis de 30 %, el LF43 se mostró ineficaz contra P. chlamydospora, pero muy útil contra Eutypa lata (71 % y 77 % de eficacia respectivamente el 2016 y 2017). Desafortunadamente, la propensión del producto a descascararse al secarse, así como su costo, desalentaron la continuación del estudio.
Figura 2. Herida de poda en Cabernet Sauvignon tratada con una capa de clorhidrato de quitosano. Fotografía tomada justo después de la aplicación.
Figura 2. Herida de poda en Cabernet Sauvignon tratada con una capa de clorhidrato de quitosano. Fotografía tomada justo después de la aplicación.
La elección fue entonces portada al OCe3, eficiente in vitro, y al clorhidrato de H90, de manera exploratoria (Tabla 2). Testeado el 2018 y 2019, a dosis de 5, 10 y 15 %, el OCe3 no permitió reducir suficientemente las infecciones de las heridas de poda por E. lata y P. chlamydospora (eficacia siempre inferior al 25 %). Este resultado fue muy sorprendente en vista de las pruebas in vitro (buena eficacia). Al contrario, H90, aplicado el 2019 al 10 %, controló significativamente las infecciones de los 2 patógenos (60 % y 58 % de eficacia, respectivamente, sobre las heridas de poda y ramillas con E. lata, y 67 % y 82 % de eficacia contra P. chlamydospora). Si bien la elevada viscosidad del clorhidrato torna difícil su aplicación por pulverización, aplicado como pintura, este forma una barrera protectora (Figura 2).
Tabla 2. Resultados de las pruebas implementadas en preventivo en el viñedo en 2018, 2019 y 2021 para evaluar la eficacia preventiva de diferentes quitosanos.
* Para las heridas de poda, las letras (a, ab, b) indican los grupos homogéneos resultantes del análisis de varianza o de un test Kruskal-Wallis (los resultados de las 30 heridas de poda fueron repartidos en 3 repeticiones de 10 heridas). **Para las ramillas de madera (25 examinadas por herida de poda), los resultados se distribuyeron en 3 clases según la cantidad de ramillas infectadas por herida: [0-5], [6-10], [11-25]. Las distribuciones se comparan enseguida por un test χ2 de comparación de distribuciones. Cada modalidad tratada es comparada al control inoculado no tratado. NS = no significativo; S = significativo (α = 5 %) ; AS = altamente significativo (α = 1 %) ; MAS = muy altamente significativo (α = 0,1 %).
Se implementó una nueva prueba en el 2021 con el clorhidrato de HA, aplicado en preventivo por pulverización (P) al 2 % o por pintado (B) al 5 % (Tabla 2).Con E. lata, el HA redujo significativamente las infecciones (62 % de eficacia en P y 63 % en B). Este efecto fue confirmado en vista de las tasas de ramillas infectadas por herida: 68 % de eficacia en P y 95 % en B. Con P.chlamydospora , el HA no redujo significativamente las infecciones de las heridas (14 % y 12 % de eficacia). En cambio, con respecto a las tasas de ramillas infectadas por el patógeno, el efecto del producto pareció mejor: 44 % en P y 34 % en B, pero no confirmado estadísticamente. Esta diferencia de eficacia, dependiente de la aplicación y del hongo estudiado, sugiere un efecto barrera cuya eficacia estaría relacionada con el PM y la solubilidad del producto, y con el tamaño de las esporas depositadas sobre la película protectora que genera el producto después de su aplicación.
Búsqueda del mecanismo de acción del clorhidrato de quitosano
Para comprender mejor la oposición de los resultados entre las pruebas in vitro e in vivo, se llevó a cabo un estudio complementario: igualmente basado en el método CEB 155, por corte de los tejidos subyacentes a las heridas en diez rodajas de alrededor de 1 mm de espesor. Este método permite ver a qué profundidad se instalan los hongos. Seis fórmulas, todas dosificadas al 5 %, fueron pintadas en preventivo sobre las heridas de poda: los oligoquitosanos OF3 y OCe3, los quitosanos LF43 y Ca50, y los clorhidratos de H90 y de HS. Los resultados mostraron una eficacia total del H90 y el HS (100 %) frente a E. lata y P chlamydospora, ya que los productos impiden que las esporas entren por debajo de la superficie de las heridas.Los quitosanos LF43 y Ca50 mostraron efectos medios (43 a 60 % de eficacia) frente a E. lata y nulos frente a P. chlamydospora. Los oligoquitosanos OCe3 y OF3 no mostraron eficacia (0 a 34 %). Este estudio complementario confirmo así el efecto barrera de los quitosanos de PM medio, y en particular de los clorhidratos solubles en agua.
Conclusión
Mientras que las pruebas llevadas a cabo primero en el laboratorio mostraron que los oligoquitosanos tenían un buen potencial de control frente a los dos hongos patógenos de la madera, fueron los quitosanos de PM medio, particularmente el clorhidrato por su solubilidad en el agua, los que se demostraron más aptos para proteger las heridas de poda en el viñedo, con una eficacia promedio sobre E. lata de 57 % para el HA aplicado en pintura (2 pruebas el 2021). Al secarse y probablemente aglomerarse, el clorhidrato parece ser capaz de atrapar las esporas que vendrían a depositarse en la superficie de las heridas. Este actuaría como un apósito, su modo de acción sería entonces principalmente físico, más fungistático que fungicida. Este podría ayudar a impedir a varios hongos patógenos ascomicetos, caracterizados por sus grandes esporas, así como basidiomicetos, penetrar en la madera, protegiendo así las heridas de poda o de corte, incluso en las cepas curetadas, para evitar reinfecciones demasiado rápidas. Es de notar que no se observó ninguna toxicidad con este producto durante el estudio. Estos trabajos son objeto del registro de una patente francesa bajo el número FR2004922. Aunque ninguna fórmula se encuentra aún disponible.
Lárez Velásquez, C. (2023). Chitosan and its applications in oenology. OENO One, 57(1), 121–132. https://doi.org/10.20870/oeno-one.2023.57.1.7262
El Hadrami, A., Adam, L. R., El Hadrami I., & Daayf, F. (2010). Chitosan in plant protection. Marine Drugs 8, 968-987. https://doi.org/10.3390/md8040968
Lecomte, P. (2005). Méthode CEB 155 : Méthode d’étude des préparations anti-fongiques utilisées en traitement des plaies de taille (Eutypiose).
Reis P., Pierron, R., Larignon, P., Lecomte, P., Abou-Mansour, E., Farine, S., Bertsch, C., Jacques, A., Trotel-Aziz, P., Rego, C., &, Fontaine, F. (2019). Vitis methods available to understand and develop strategies for diagnosis and management of grapevine trunk diseases. Phytopathology 109(6): 916–931. https://doi.org/10.1094/Phyto-09-18-0349-RVW