Os vinhos experimentais são tipicamente produzidos em garrafões de 10 a 25 litros, mas esta escala não é viável para estudos genéticos que envolvam centenas de genótipos. Assim sendo, é necessária uma metodologia simples e padronizada, que possa ser aplicada numa escala muito mais reduzida, permitindo uma análise enológica de vinhos brancos de alto rendimento. Para resolver esta questão, desenvolvemos um protocolo específico para a produção de vinhos brancos a partir de menos de 100 ml de mosto. Avaliamos o método TTV em castas comerciais e genótipos de uma progénie bi-parental, abrangendo uma ampla paleta aromática. Os vinhos foram analisados utilizando parâmetros enológicos padrão e perfil GC-MS de compostos voláteis.

Foram colhidos entre 1 e 2,5 kg de uvas de uma seleção de castas comerciais (Riesling, Gewurztraminer, Chardonnay, Chasselas, Floreal e Muscat à Petits Grains Blancs – em português: Moscatel Galego Branco) bem como de quatro genótipos selecionados a partir da progénie de um cruzamento bi-parental entre Riesling e Gewurztraminer1, representando uma ampla paleta aromática. Os mostos foram obtidos após prensagem dos bagos, utilizando uma Peneira Automática C80® (ROBOT COUPE SNC, Vincennes, França) e foram adicionados 6g de SO₂/ hl antes da centrifugação (3500 rpm, 10 min). Após 24h de decantação a 10°C e trasfega, os mostos clarificados foram suplementados com i) mosto concentrado retificado, para obter uma concentração alcoólica final 12,5% e ii) fosfato de diamónio, para obter 200 mg/ l de azoto assimilável. Os mostos foram inoculados com a levedura Levulia® GC (AEB-France, Sigolsheim, França). O mosto de cada casta foi então distribuído em cinco tubos de 85 ml para a fase de fermentação, que foi realizada em ambiente com temperatura controlada a 22 °C (Figura 1). No final da fermentação, os vinhos obtidos foram estabilizados com 8g de SO₂/ hl e armazenados numa câmara fria a 10 °C antes da análise.

Foi necessário um espaço 0,3 m² para realizar 50 TTVs. Duas pessoas executaram as operações de pré-fermentação, incluindo o desengace, esmagamento, extração do sumo, decantação e a adição de levedura. O processo de vinificação foi monitorizado por uma única pessoa.

Figura 1. Configuração experimental de vinificação em tubo de ensaio. Foram transferidos 85 ml de mosto para tubos de vidro de 100 ml: a) selados com uma rolha de borracha, b) equipados com um tubo flexível para borbulhamento, c) cuja extremidade foi imersa num tubo com água (d) para prevenir a oxidação do vinho durante a fermentação.

Todas as fermentações realizadas pelo método TTV quase atingiram a secura em 25 dias. Os valores dos parâmetros enológicos (pH, açúcares residuais e teor alcoólico) dos vinhos resultantes estavam em conformidade com os padrões enológicos habituais (Tabela 1).

Para investigar a capacidade do método TTV para discriminar castas, foi realizado um perfil de compostos voláteis. Os compostos voláteis foram extraídos de amostras de três ml de cada vinho utilizando micro extração em fase sólida de headspace (HS-SPME) e analisados por cromatografia gasosa-espectrometria de massa (GC-MS). Um total de 108 compostos voláteis de diferentes famílias químicas foi identificado. Estes incluíram compostos aromáticos derivados da fermentação, tais como ésteres, ácidos gordos voláteis e álcoois superiores, bem como compostos varietais, tais como monoterpenos, C13-norisoprenóides e C15-sesquiterpenos. Alguns benzenóides, aldeídos, cetonas e lactonas também foram detetados. Os tióis voláteis foram analisados utilizando um método de extração específico descrito por Thibon et al2.

Os resultados, resumidos na Figura 2, demonstram que o método TTV pode discriminar castas com base no seu perfil volátil. Castas intensamente aromáticas do tipo Moscatel (Muscat, 0074E) apresentam cargas positivas tanto no Eixo 1 (Dim1) quanto no Eixo 2 (Dim2) (Figura 2A) e apresentam altos níveis de monoterpenos, como linalol e α-terpineol (Figura 2B). O genótipo 4095G é caracterizado por uma coordenada positiva alta em Dim1 e uma coordenada negativa em Dim2, associada a níveis elevados de monoterpenos. Estes compostos varietais contribuem para as características florais, frutadas e cítricas destes vinhos3. As variedades aromáticas não-Moscatel, como Riesling e Gewurztraminer, com cargas negativas em Dim1 e Dim2, são separadas de castas não aromáticas, como Chasselas e Chardonnay, com cargas positivas em Dim1 e cargas negativas em Dim2. O Gewurztraminer apresentou altos níveis de terpenóis, destacando-se o mais alto teor de citronelol de todas as castas estudadas. O Riesling e o genótipo 0238E apresentaram os níveis mais elevados de TDN, um composto C13-norisoprenóide conhecido pelo seu aroma a petróleo ou odor a "pedra húmida" em vinhos jovens Riesling, contribuindo significativamente para a tipicidade aromática desta casta4 5. Altas concentrações de 3-sulfanilhexan-1-ol (3SH) foram encontradas em Gewurztraminer e 4095G, com níveis particularmente altos em 0074E. Contrariamente, 4-metil-4-sulfanilpentan-2-ona (4MSP) só foi detetado em Floreal e 0074E. Estes tióis voláteis são apreciados pelos seus agradáveis aromas frutados, que lembram gomos de groselha preta, maracujá e toranja.

Figura 2. Perfil dos compostos voláteis em vinhos produzidos pela vinificação em tubo de ensaio (TTV). A) Análise de componentes principais (PCA), que ilustra a discriminação dos vinhos com base nas castas. (B) Variação de compostos voláteis significativos selecionados nas diferentes amostras de vinho. TDN: 1,1,6-trimetil-1,2-diidronaftaleno, 3SH: 3-sulfanil-hexan-1-ol, 4MSP: 4-metil-4-sulfanil-pentan-2-ona.

O nosso estudo demonstra que o método TTV é altamente eficaz na produção de vinhos brancos numa escala muito pequena (ou seja, menos de 100 ml), refletindo fielmente o potencial aromático de diferentes castas. Este método de vinificação em pequena escala e de alto rendimento permite a produção de centenas de vinhos brancos, possibilitando a avaliação do potencial enológico de numerosos genótipos de videira a partir da colheita de uma única videira. Esta abordagem de fenotipagem direta orientada para o vinho foi concebida para abrir caminho para a determinação genética científica dos aromas do vinho, particularmente para compostos não diretamente presentes nas uvas; esta metodologia abre também nas perspetivas para a melhoria genética de castas com características desejáveis.

Além disso, esta técnica oferece vantagens significativas para os profissionais da indústria do vinho, como enólogos e departamentos de I&D (pesquisa e desenvolvimento) na produção vinícola, pois fornece um meio rápido e eficiente em termos de recursos para avaliar técnicas de fermentação ou tratamentos em pequena escala antes da implementação em larga escala. Este método pode ser potencialmente utilizado para estudar a dinâmica da fermentação, explorar o potencial enológico de estirpes de leveduras, avaliar a estabilidade do vinho e investigar o impacto de diferentes práticas vitícolas e fatores ambientais na qualidade do vinho.