Resultados interessantes foram obtidos em relação à cor e à composição fenólica dos vinhos derivados da inoculação com T. delbrueckii no início da maceração carbónica. A presença de T. delbrueckii provocou um aumento significativo da concentração de antocianinas nos vinhos finais, especialmente com a estirpe TdV (Figura 2A). Esta concentração mais elevada pode ser devida a várias causas, tais como a maior oxidação das antocianinas nos vinhos de controlo, que demoraram mais tempo a iniciar a FAL. Por outro lado, este efeito pode também estar associado a uma atividade pectolítica elevada, que foi observada em certas leveduras não Saccharomyces; no entanto, esta atividade ainda não foi demonstrada para T. delbrueckii. Foram também encontradas diferenças nas piranoantocianinas, Vitisina A e Vitisina B (Figura 2B). Estes pigmentos desempenham um papel importante na melhoria da estabilidade da cor dos vinhos, uma vez que são menos suscetíveis às alterações de pH e mais resistentes à descoloração causada pelo dióxido de enxofre3. As amostras de controlo no final do CM foram significativamente diferentes das inoculadas com T. delbrueckii, uma vez que não foram detetadas piranoantocianinas. Pelo contrário, tanto as amostras TdP como as TdV mostraram a presença destes pigmentos após o CM. No entanto, após a FA, as piranoantocianinas foram detetadas em todos os vinhos, sendo as suas concentrações mais elevadas nos vinhos com T. delbrueckii do que no Controlo. Durante a fase CM, não se registaram diferenças significativas na intensidade da cor (IC) entre as diferentes condições. No entanto, após a FA, os vinhos de controlo apresentaram uma redução significativa da IC, e foi possível diferenciar visualmente os vinhos de controlo dos inoculados com T. delbrueckii (Figura 2C).

Figura 2. Compostos fenólicos analisados. A) Antocianinas livres analisadas por HPLC; B) Piranoantocianinas (Vitisinas A e B). C) Diferenciação dos vinhos a olho nu: Controlo (esquerda) e vinho inoculado com T. delbrueckii Prelude (direita). O fim da MC corresponde à amostragem após a maceração carbónica, antes da inoculação de S. cerevisiae, e o fim da FAL corresponde à amostragem após a fermentação alcoólica (FAL). Controlo corresponde à fermentação de Controlo; TdP e TdV correspondem a fermentações com T. delbrueckii Prelude ou T. delbrueckii Viniferm, respetivamente. Letras diferentes correspondem a diferenças significativas entre grupos (p < 0,05). Todos os dados são expressos como a média aritmética de três réplicas biológicas ± desvio padrão (n = 3).

A inoculação com as duas estirpes de T. delbrueckii influenciou significativamente o perfil volátil e as caraterísticas organoléticas gerais dos vinhos. As diferenças foram observadas principalmente após a FA com T. delbrueckii, com um aumento nas famílias de ésteres etílicos, álcoois superiores, ácidos gordos de cadeia curta (SCFAs) e acetatos de álcoois superiores. Os compostos que mais aumentaram foram o 1-propanol, o 2-metilpropanol, o acetato de isoamilo, o acetato de 2-feniletanol, o decanoato de etilo, o dodecanoato de etilo e o isopropanol; estes foram caracterizados pelos descritores: álcool, vinho, banana, rosa, uva e folhas. A estirpe TdP apresentou um aumento significativamente maior nas concentrações de 2-feniletanol, 2-metilpropanol e acetato de isoamilo do que a estirpe TdV. O acetato de isoamilo é um composto caraterístico dos vinhos CM4 cujo descritor é banana. Este composto atingiu concentrações de 0,62 mg/L (Controlo), 0,63 mg/L (TdP) e 0,47 mg/L (TdV) após a CM sem diferenças significativas. No entanto, os vinhos TdP e TdV apresentaram um aumento significativo da concentração de acetato de isoamilo após a FA, atingindo concentrações de 3,37 mg/L e 1,32 mg/L, respetivamente, em relação ao vinho Controlo FA a 0,58 mg/L (Figura 3A).

Por último, para compreender de forma abrangente o impacto da inoculação de T. delbrueckii durante a MC, foi efetuada uma análise sensorial após a FA. Foi efetuado um teste triangular por 15 júris treinados, utilizando óculos pretos para minimizar o enviesamento visual. Os resultados mostraram diferenças significativas entre o Controlo e o TdP, bem como entre o Controlo e o TdV, mas nenhuma distinção entre o TdP e o TdV. Posteriormente, foi efetuada uma prova descritiva dos vinhos após a FA: o vinho TdV apresentou aromas intensos a frutos vermelhos, erva e banana, bem como valores de perceção geral mais elevados, enquanto que no caso do vinho TdP, o aroma a banana e a perceção geral melhoraram em comparação com o vinho de controlo. Surpreendentemente, o aroma a banana foi o único descritor responsável por uma diferença significativa entre os vinhos com T. delbrueckii e o vinho de controlo (Figura 3B). Isto sugere que os consumidores associaram um aroma de banana mais pronunciado à presença de T. delbrueckii durante a MC.

Figura 3. Concentração de acetato de isoamilo (mg/L) (A). Diagrama em teia de aranha da análise sensorial dos vinhos após FAL (B). Os asteriscos (*) indicam os atributos que apresentaram diferenças significativas (P < 0,05). Controlo corresponde à condiçoes de controlo fermentadas apenas com Sc; TdP e TdV correspondem às fermentações com T. delbrueckii Prelude e Viniferm, respetivamente. Todos os dados são expressos como a média aritmética de três réplicas biológicas ± desvio padrão (n = 3).

Uma vez concluída a FA, foram aplicadas três estratégias de FML: inoculação com as estirpes OoVP41 e OoCH11 de O. oeni e fermentação espontânea. A inoculação com culturas iniciadoras de O. oeni foi efetuada de forma a avaliar o seu potencial sob a pressão competitiva das BAL endógenas.

A Figura 4 mostra a cinética da FML das três condições do vinho com as suas respetivas estratégias de FML. A inoculação com OoVP41 resultou numa duração mais curta da FML do que a inoculação com OoCH11 e do que na FML espontânea. Os vinhos TdP e TdV que foram inoculados com OoVP41 completaram a FML dois dias mais cedo (i.e., em 8 dias) do que os vinhos de controlo com a mesma estirpe (em 10 dias). Estudos anteriores executados em condições de laboratório5 caracterizaram igualmente a estirpe OoVP41 como uma estirpe fermentativa muito eficaz, corroborando este resultado nestas condições de concorrência. A influência da T. delbrueckii na FML também foi observada quando se utilizou a estirpe OoCH11. Foram observadas diferenças significativamente maiores na FML espontânea. Os vinhos de controlo levaram 7 dias para iniciar a FML, enquanto a TdP levou 4 dias e a TdV apenas 3 dias. No que diz respeito à duração total da FML, a TdP e a TdV foram igualmente mais curtas: a TdP durou 15 dias e a TdV 16 dias, o que é notavelmente inferior ao Controlo, que necessitou de 20 dias (Figura 4). O efeito de T. delbrueckii na FML está associado a vários fatores que contribuem para melhorar a eficiência de O. oeni6. No presente estudo, apesar de não terem sido encontradas diferenças nos níveis de etanol ou pH, o melhor desempenho da FML pode ser atribuído a uma redução dos AGCM (ácidos gordos de cadeia média), conhecidos por serem tóxicos para a O. oeni7, ou a um aumento do amónio e das manoproteínas. Para além dos aspetos nutricionais, o aumento das manoproteínas pode estar relacionado com a redução dos AGCM, uma vez que podem absorver estes lípidos, desintoxicando o ambiente8.

Figura 4. Consumo de ácido L-málico pelas estirpes de Oenococcus oeni durante a fermentação malolática: (A) corresponde à FML OoVP41, (B) corresponde à FML OoCH11 e (C) corresponde à FML espontânea. Controlo corresponde as condições de controlo fermentada sapenas com Sc; TdP e TdV correspondem a fermentações com T. delbrueckii Prelude e Viniferm, respetivamente. Todos os dados são expressos como a média aritmética de três réplicas biológicas ± desvio padrão (n = 3).