Introdução

Há quase dois mil anos, as pessoas têm usado recipientes de madeira para o transporte e a produção de vinhos e licores. Ao longo dos séculos, o tipo de madeira utilizado para fazer barricas, as respetivas técnicas de conceção e o uso dado às mesmas evoluíram com base na observação empírica e na experiência. Hoje em dia, as barricas são, quase na sua totalidade, feitas de carvalho; são reservadas para o estágio e, por vezes, a vinificação. A composição dos vinhos, a sua estabilidade e as suas características organoléticas sofrem alterações ao entrarem em contacto com o carvalho. Na prática, observam-se os contributos dos compostos que influenciam o aroma e o sabor. A origem molecular do contributo do contacto dos vinhos com o carvalho, para o seu aroma, é bem conhecida. A vanilina, lactona do whisky/carvalho (whyski lactone), os fenóis voláteis, como o eugenol ou o guaiacol, e o 2-furanometanotiol são os principais compostos voláteis.

Paralelamente a este contributo aromático, demonstrou-se que o sabor adocicado dos vinhos secos se acentua ao contactarem com o carvalho e que os compostos voláteis, como a vanilina, não são responsáveis por este fenómeno¹. No entanto, o contributo do carvalho ao nível dos compostos que influenciam o sabor permanece, em larga medida, desconhecido.

Desenvolvimento de um protocolo de purificação orientado pelo sabor

De modo a caracterizar as moléculas presentes no carvalho responsáveis pela intensificação do sabor adocicado observada durante o estágio, adotou-se uma abordagem indutiva. Recorreu-se a várias técnicas de separação e, no final de cada etapa, provou-se as diferentes porções, de forma a manter apenas as mais adocicadas. Submeteu-se, deste modo, um macerado de carvalho não tostado a sucessivas extrações líquido-líquido e, em seguida, a cromatografia de partição centrífuga (CPC). Esta técnica, frequentemente utilizada na farmacognosia para a procura de moléculas bioativas, possibilitou o fracionamento do extrato. A sua junção à análise organolética, pela primeira vez, foi apelidada de CPC-Gustometria, por analogia com a Cromatografia-Olfactometria Gasosa utilizada na análise de aromas. A sua utilização permitiu isolar uma porção adocicada que continha quatro compostos, os quais, em seguida, foram purificados por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). O sabor adocicado de dois destes compostos foi comprovado. A sua caracterização através da espectroscopia de ressonância magnética nuclear revelou tratar-se de triterpenos glucosilados e galoilados. Estes compostos, nunca dantes identificados na natureza, foram designados por Quercotriterpenósido (QTT) I e II (Fig. 1)². O estudo das respetivas propriedades organoléticas demonstrou que estes compostos de sabor adocicado reduzem a perceção de amargura. O limiar de deteção do QTT I comprovado no vinho é de 590 µg/L, mais de 6000 vezes inferior ao da glucose.

A procura por novos triterpenos sápidos

A descoberta destes dois compostos adocicados trouxe a lume a família dos triterpenos, que tinha sido pouco estudada no carvalho. De forma a superar esta ausência de conhecimento, utilizou-se a espectrometria de massa com transformada de Fourier para aferir a presença de outros triterpenoides no carvalho, distintos dos QTT pela natureza da sua aglicona (a sua estrutura básica) ou pela posição, pelo número e pelo tipo dos seus grupos funcionais. Este rastreio revelou a existência de uma grande quantidade de compostos, na sua maioria passíveis de isolamento³. Foram purificados, no total, 39 compostos, dos quais 23 nunca tinham sido identificados e 12 outros nunca tinham sido observados no vinho (Fig. 1). Apenas quatro triterpenos, sem um grupo de galatos, já tinham sido identificados⁴. Um dos mesmos, o Glu-AB (derivado glucosilado do ácido bartogénico), adquire uma ligeira amargura, o mesmo se aplicando a diversos compostos com estruturas semelhantes. Os derivados dos QTT, no entanto, desenvolvem, essencialmente, um sabor adocicado.

Figura 1. Estruturas químicas de alguns triterpenos do carvalho.

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Influência da espécie de carvalho sobre o teor de QTT

Desenvolveu-se e validou-se um método de rastreio do QTT I, II e III (todos adocicados), bem como do Glu-AB (amargo), por cromatografia líquida aliada a espectrometria de massa de alta resolução (LC-HRMS). Este método foi aplicado a extratos de carvalho para estudar a influência das respetivas espécies sobre a composição dos triterpenos. Com este objetivo, recolheram-se amostras de 46 árvores em 8 florestas francesas: uma amostra foliar, para determinar a espécie por análise genética, em colaboração com a UMR (Unidade Mista de Investigação) Biogeco do INRA e da Universidade de Bordéus⁵, uma amostra de madeira, para quantificar os QTT I, II, III e o Glu-AB por LC-HRMS.

Em cada floresta, foram observadas amostras de ambas as espécies (27 de carvalho-alvar e 19 de carvalho-alvarinho). Foram detetados triterpenos em todas as amostras, em concentrações iguais ou inferiores a 1 mg/g de madeira. A realização de um teste estatístico evidenciou um teor de QTT nas amostras de carvalho-alvar significativamente superior ao das de carvalho-alvarinho⁶. Pelo contrário, o carvalho-alvarinho continha uma quantidade superior de Glu-AB. Esta tendência foi idêntica entre amostras da mesma floresta, sugerindo que a influência da origem botânica do carvalho sobre a composição dos triterpenos da madeira é superior à da origem geográfica. Em cada composto, observou-se uma acentuada variabilidade entre indivíduos da mesma espécie, reforçando a tendência já observada no caso da β-metil-γ-octalactona (lactona do whisky/carvalho), mais abundante no carvalho-alvar⁷, ou dos elagitaninos, presentes em maior quantidade na madeira do carvalho-alvarinho⁸.

Figura 2. Concentrações médias de QTT I, II, III e Glu-AB medidas em amostras de madeira de carvalho-alvar e alvarinho.

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Estes resultados comprovaram a vincada influência da espécie de carvalho sobre o teor de triterpenos e indiciam as respetivas consequências organoléticas. O carvalho-alvar é, de facto, mais rico em triterpenos adocicados (QTT), enquanto o carvalho-alvarinho apresenta uma maior quantidade de triterpenos amargos (Glu-AB). Dada a acentuada variabilidade observada entre indivíduos de cada espécie, nenhum destes compostos de triterpenos possibilita, por si só, uma identificação exata da origem botânica de uma amostra de madeira. O mesmo se aplica aos outros compostos passíveis de extração do carvalho conhecidos até à data, pelo que a identificação da espécie de uma amostra só é possível por meio das análises genéticas supramencionadas. No entanto, o exame dos cromatogramas obtidos durante a análise das 46 amostras evidenciou um certo grau de influência da espécie sobre o perfil dos triterpenos presentes no carvalho. De forma a converter o referido perfil num valor quantificável, definiu-se um índice de triterpenos (TI), do seguinte modo:

$TI=\log \frac{\left[\mathrm{Q}\mathrm{T}\mathrm{T}\mathrm{ }\mathrm{I}\right]+\left[\mathrm{Q}\mathrm{T}\mathrm{T}\mathrm{ }\mathrm{I}\mathrm{I}\right]+\left[\mathrm{Q}\mathrm{T}\mathrm{T}\mathrm{ }\mathrm{I}\mathrm{I}\mathrm{I}\right]}{\left[\mathrm{G}\mathrm{l}\mathrm{u}-\mathrm{A}\mathrm{B}\right]}$

Figura 3. Valores médios do TI calculado para as 46 amostras de carvalho-alvar e alvarinho analisadas.

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O TI médio foi positivo, no caso do carvalho-alvar, e negativo, no do carvalho-alvarinho (1,9 e -1,5, respetivamente), tendo sido observadas diferenças significativas entre as duas espécies, de 0,1 %. Além disso, o desvio-padrão obtido, no caso de ambas as espécies, foi muito reduzido, refletindo uma diminuta diferença entre indivíduos. A medição do TI na madeira aparenta, assim, ser o primeiro método químico de identificação das espécies de carvalho utilizadas na tanoaria. Deu origem a uma patente, registada na Europa e nos Estados Unidos, cuja concretização está em curso.

Conclusão

O trabalho empreendido para explicar os compostos responsáveis pelo aumento da perceção do sabor adocicado adquirido durante o estágio em barricas de carvalho conduziu à identificação de vários triterpenos presentes na árvore. Estes compostos dependem, em grande medida, da espécie de carvalho utilizada na tanoaria. Tornou-se possível distinguir o carvalho-alvar do alvarinho, através de uma simples análise química do carvalho envelhecido ou mesmo tostado. Este trabalho cria novas perspetivas para a seleção do carvalho a utilizar na tanoaria e a sua adaptação à identidade dos vinhos produzidos.