Introdução

A higienização das adegas está no âmago das diretrizes de controlo de contaminações microbianas e, em particular, da contaminação pela Brettanomyces bruxellensis. De facto, esta levedura deteriorante é capaz de sobreviver em condições de stress, como, por exemplo, na presença de sulfitos^{1 2 3}. A capacidade de formar um biofilme é uma potencial estratégia de resistência desenvolvida por certas leveduras⁴, apesar de o caso da B. bruxellensis ter sido pouco estudado até ao presente. Os biofilmes definem-se como uma comunidade de um ou mais tipos de micro-organismos, que aderem a superfícies bióticas e abióticas e podem crescer nas três dimensões, incorporados numa matriz autoproduzida designada por SPE (Substâncias Poliméricas Extracelulares)⁵. Num estudo recente, levado a cabo no IUVV (Dijon, França), o biofilme da B. bruxellensis foi descrito como uma estrutura fina, que consiste em diferentes morfologias celulares, incluindo células de levedura e células pseudofilamentosas incorporadas numa matriz extracelular (Figura 1)⁶. Além disso, demonstrou-se a persistência de células do biofilme em superfícies ao longo do tempo.

Atualmente, o processo de limpeza de cubas mais comum consiste na aplicação de uma mistura de soluções químicas diluídas que contêm detergentes alcalinos e soluções ácidas⁷. No entanto, tem-se procurado alternativas ecológicas que sejam eficazes no combate a todas as formas de sobrevivência da B. bruxellensis, de modo a reduzir a utilização de químicos no setor vinícola. Neste contexto, pretendeu-se estudar o impacto de dois métodos distintos de higienização (uma solução de soda cáustica espumosa e peróxido a 5&nbsp% e uma solução de ácido láctico a 5&nbsp%) sobre as estirpes de Brettanomyces desenvolvidas no biofilme.

Figura 1. Observações por MEV (x 500) de um biofilme de Brettanomyces bruxellensis com um mês de idade, desenvolvido sobre uma apara de aço inoxidável, num meio YPD. A superfície está coberta de microcolónias, que contêm levedura e células filamentosas (indicadas por uma seta branca).

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Tentativa de remoção de biofilmes de Brettanomyces bruxellensis

Foram utilizadas cinco estirpes de B. bruxellensis de diversas origens (Tabela 1) e, para cada estirpe, formados biofilmes com catorze dias de idade, sobre aparas de aço inoxidável, num meio sintético (Extrato de Levedura-Peptona-Dextrose (YPD)), comummente utilizado para a cultura de leveduras em laboratórios de investigação, de modo a avaliar dois métodos diferentes de higienização.

Anteriormente à formação de biofilmes, assegurou-se, por meio de inóculos, que as células se encontrassem no mesmo estado fisiológico, possibilitando uma comparação exata da capacidade de formação de biofilmes de diferentes estirpes. De facto, a cinética do crescimento depende de cada estirpe, sendo a BR17 mais lenta do que as restantes (Tabela 1). Por outro lado, a estirpe GS04 registou o crescimento mais rápido. Contudo, confirmou-se a capacidade de aderência e de formação de biofilme em aparas de aço inoxidável de todas as estirpes investigadas, com uma população inicial, no biofilme da apara, em torno das 10^6&nbspcélulas/cm², em todos os casos, após 14&nbspdias de incubação (Figura 2).

Tabela 1. Origem e parâmetros de crescimento das estirpes de B. bruxellensis.

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Figura 2. Concentração de populações celulares viáveis ou cultiváveis (células/cm²) de cinco estirpes da B. bruxellensis após o processo de higienização de acordo com o método da adega (A) e com ácido láctico a 5 % (B). O termo “células aderentes” corresponde às células fixas à superfície da apara após o tratamento. As diferentes letras representam uma diferença significativa (valores de P ≤ 0,05) entre as populações celulares que aderiram às aparas. Limite de deteção das técnicas: 706 células/cm² (citómetro: viáveis; linha tracejada), 12 células/cm² (placa: cultiváveis; linha contínua).

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. O efeito do método da adega

O método da adega ou método de referência, utilizado pela cave da Inter Rhône, consiste na aplicação de uma solução de soda cáustica espumosa e peróxido a 5%. No final do processo de limpeza, os biofilmes foram, deste modo, expostos à referida solução durante 15&nbspmin. e as populações da apara foram determinadas em meios de ágar (população cultivável) e por citometria de fluxo (população viável). Não foram detetadas quaisquer células restantes nas aparas após o tratamento de três estirpes, S11, GS04 e GS12, comprovando-se, assim, a eficácia deste método (Figura 2A). Porém, no caso das estirpes BR17 e S14, foram detetadas algumas células viáveis por citometria de fluxo, tendo-se revelado, deste modo, a existência de células num estado viável, mas não cultivável (VBNC)⁸.

. O efeito do ácido láctico

De modo a investigar um procedimento alternativo de limpeza de equipamentos vinícolas, testou-se uma abordagem ecológica. Os biofilmes foram tratados com uma solução de ácido láctico a 5%, durante 15&nbspmin., e as populações das aparas de aço inoxidável foram determinadas da forma anteriormente descrita. Os resultados evidenciam uma redução significativa da população de células cultiváveis nas aparas após o tratamento com ácido láctico, em todos os casos, exceto no da estirpe GS12 (Figura 2B). No entanto, este tratamento não eliminou a totalidade das células.

Estes ensaios demonstram um comportamento diferente consoante as estirpes e o tipo de tratamento. A estirpe GS12 parece ser ligeiramente mais tolerante do que as restantes ao método do ácido láctico. Por outro lado, as estirpes BR17 e S14 aparentam uma maior tolerância ao método da adega, mediante a indução do estado VBNC, ao passo que as populações das três outras estirpes foram totalmente erradicadas. Este estado VBNC poderá explicar a resistência destas duas estirpes a diversos produtos químicos e ser a causa da recontaminação anual das cubas, uma vez que as células podem recuperar do estado VBNC após o desaparecimento das condições de stress.

Conclusão

Todas as estirpes testadas, não obstante a origem, foram capazes de formar biofilmes em aço inoxidável (cerca de 10^6&nbspcélulas/cm²), após 14 dias de incubação num meio YPD. Atualmente, a solução de ácido láctico não é um tratamento suficientemente rigoroso para erradicar a B. bruxellensis, embora constitua uma abordagem promissora, que poderá ser melhorada através do aumento do período de contacto ou da concentração da solução. O método da adega demonstrou a sua eficácia, apesar de duas estirpes exibirem células VBNC após o tratamento. Estes resultados comprovam que, tal como no caso do SO_{2^{9 10 11}}, a higienização representa um fator de stress para leveduras com uma reação dependente da estirpe. O desenvolvimento de métodos económicos e fiáveis de deteção que sejam reproduzíveis ao nível das estirpes poderá permitir a previsão e o controlo da contaminação pela B. bruxellensis.