Ein Biofilm ist eine Gemeinschaft von Mikroorganismen, die irreversibel an eine Oberfläche gebunden und in eine selbst produzierte Matrix eingebettet sind, wodurch sie zusammengehalten werden. Diese weit verbreitete Wachstumsstrategie fördert die Besiedlung von Oberflächen sowie die Beständigkeit in verschiedenen Umgebungen, und trägt auch zu einer erhöhten Stressresistenz bei¹. Die Fähigkeit von Brettanomyces bruxellensis, der bedeutendsten Schadhefe in Weinen, Biofilme zu bilden, ist in der Literatur nur unzureichend beschrieben. Der Nachweis, dass B. bruxellensis in der Lage ist, auf Oberflächen von Weinherstellungsgeräten zu haften und Biofilme zu bilden, würde die Entwicklung geeigneter Strategien für dessen effiziente Entfernung ermöglichen. In diesem Zusammenhang waren die Ziele dieser Studie: erstens, nachzuweisen dass B. bruxellensis tatsächlich in der Lage ist, Biofilme zu bilden; zweitens, die verschiedenen Zellstrukturen innerhalb dieser Biofilme unter Verwendung der Mikroskopie zu beschreiben; und drittens, den Einfluss von Wein auf bestehende Biofilme, die von zwei B. bruxellensis-Stämmen produziert wurden, zu untersuchen.

Biofilmbildung und -struktur in Wein

Die Zellen zweier ausgewählter Stämme (mit "11" und "14" bezeichnet und zuvor aus Weinherstellungsgeräten isoliert) wurden zunächst, wie von Longin et al., (2016)² beschrieben, an die typischen in Rotweinen herrschenden Bedingungen (Alkoholkonzentration und pH) angepasst. Darüber hinaus stellten Starterkulturen sicher, dass sich die Zellen vor der Biofilmbildung im gleichen physiologischen Stadium befanden, welches dem Ende der exponentiellen Wachstumsphase entsprach. Dies gewährleistete einen genaueren Vergleich beider Stämme. Die Biofilmbildung von B. bruxellensis in Wein wurde auf Edelstahlchips durch Anpassung eines etablierten Protokolls untersucht³: Edelstahlchips (25&nbsp×&nbsp25&nbspmm) wurden in 15&nbspml Rotwein getaucht, der mit 5,0&nbsp×&nbsp10⁵&nbspKBE/mL Zellen beimpft worden war. Nach 7- bzw. 14-tägiger Inkubation bei 28&nbsp°C wurden die Zellen durch Ultraschallbehandlung abgelöst. Die Anzahl kultivierbarer Zellen wurde durch Ausplattierung auf YPD-Medium bestimmt, und die Biofilmstruktur mithilfe der Rasterelektronenmikroskopie (SEM) untersucht.

Die Adhäsion und Biofilmbildung beider Stämme auf dem Chip in Wein wurden nach 2&nbsph und 24&nbsph, und nach 7 und 14 Tagen Inkubation unter Verwendung des eben beschriebenen Protokolls untersucht. Die Hefekulturen wurden anfänglich mit etwa 10⁶&nbspKBE/mL beimpft (Tabelle&nbsp1). Die Adhäsionsrate von Stamm 14 (0,69&nbsp%) war im Vergleich zu Stamm 11 (5,69&nbsp%) relativ niedrig. Dieser Unterschied blieb während der ersten 7 Tage bestehen. Dies änderte sich jedoch nach 14 Tagen Inkubationszeit, obwohl für beide Stämme im Wein kein zusätzliches Biofilmwachstum beobachtet wurde (Tabelle&nbsp1). Dies zeigt, dass sich B. bruxellensis unter rauen Bedingungen, wie sie im Wein zu finden sind, an Oberflächen anhaften und Biofilme bilden kann. Das Biofilmwachstum ist jedoch nach 14 Tagen Inkubationszeit relativ schwach.

Parallel dazu wurden für die beiden Stämme 11 und 14, nach 7-tägiger Inkubation auf Edelstahlchips, Mikrokolonien beobachtet, die in extrazelluläre polymere Substanzen (EPS) eingebettete Zellen enthielten (Abbildung&nbsp1A). Diese Mikrokolonien bestanden zudem aus zahlreichen filamentösen Zellen, die vermutlich eine strukturelle Rolle im Biofilm spielen (Abbildung&nbsp1A). Weiterhin zeigten mikroskopische Untersuchungen auch das Vorhandensein von Strukturen, die größer als die übliche Hefezelle waren, mit dicken Zellwänden, die sich von filamentöse Zellen ableiteten (Abbildung&nbsp1B). Diese Eigenschaften sind charakteristisch für Chlamydosporen-ähnliche Strukturen, wie zuvor für C. albicans beschrieben wurden⁴.

Abbildung 1. A) REM-Aufnahmen von 7 Tage alten Mikrokolonien der Stämme 11 und 14, die in Rotwein auf Edelstahlchips inkubiert wurden. Vergrößerungen: 500 x (Entwicklung der Mikrokolonien auf der Edelstahloberfläche) und 7000 x (filamentöse Zellen und EPS sind mit den weißen Pfeilen No1 bzw. No2 gekennzeichnet). B) REM-Aufnahme von 14 Tage alten Mikrokolonien des Stammes 14, die in Rotwein auf Edelstahlchips inkubiert wurden. Die Vergrößerung ist 7000 x (eine Chlamydosporen-ähnliche Struktur ist mit einem weißen Pfeil gekennzeichnet).

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Tabelle 1. Mikrokoloniewachstum der Stämme 11 und 14 in Wein auf Edelstahlchips nach 2 bzw. 24 Stunden, und nach 7 bzw. 14 Tagen. Die Werte stellen den Durchschnitt von drei unabhängigen biologischen Replikaten mit Standardabweichungen (Werte in grau) dar. Das Zeichen * zeigt einen signifikanten Unterschied (ANOVA, p-Wert ≤ 0,05) zwischen den beiden Stämmen für einen bestimmten Zeitpunkt an.

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Der Einfluss von Wein auf den Biofilm von B. bruxellensis

Die Biofilme wurden zunächst auf Edelstahlchips in YPD-Medium produziert (wie zuvor beschrieben). Nach 7-tägiger Inkubation wurden die Chips mit den in Biofilmen befindlichen Zellen in Wein übertragen. Dies erlaubte, den Einfluss des Weines auf einen 7 Tage alten B. bruxellensis Biofilm zu untersuchen. Zwei verschiedene Zelltypen wurden gezählt: (i) diejenigen, die im Biofilm verblieben sind, und (ii) diejenigen, die in den Wein freigesetzt wurden (Abbildung&nbsp2). Für beide Stämme nahm die Menge an Zellen innerhalb der Biofilme nach 24&nbsph signifikant ab, blieb danach jedoch bis zu 14 Tage stabil (Abbildung&nbsp2A und 2B). Wie zuvor beschrieben, hatte der Wein einen stärkeren negativen Effekt auf Stamm 14 im Vergleich zu Stamm 11. Eine beträchtliche Menge an Zellen wurde aus den Biofilmen beider Stämme schon 2&nbsph (ca.10⁶&nbspKBE/ml) nach der Übertragung in Wein registriert (Abbildung&nbsp2A und 2B). Für Stamm 14 wurde in den darauffolgenden 24&nbsph eine Abnahme der Anzahl freigesetzter Zellen beobachtet, die dann bis zu 7 Tage stabil blieben. Danach folgte ein erneuter Anstieg zwischen den Tagen 7 und 14. Das gleiche Verhalten wurde in einem geringeren Maß für Stamm 11 beobachtet.

Abbildung 2. Mikrokolonieverhalten in Wein für (A) Stamm 11 und (B) Stamm 14. Die Zellpopulation auf dem Chip ist in log10(KBE/cm²) und die in den Wein freigesetzte Zellpopulation ist in log10(KBE/ml) dargestellt. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung zwischen drei unabhängigen Replikaten. Verschiedene Buchstaben kennzeichnen signifikante Unterschiede (ANOVA, p-Wert ≤ 0,05).

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Fazit

In dieser Studie wurde gezeigt, dass die Schadhefe B. bruxellensis in Wein in der Lage ist, Biofilme auf Edelstahloberflächen zu bilden. Wie für andere Mikroorganismen beschrieben⁵, ermöglicht der Biofilm-Lebensstil B. bruxellensis, in Wein und unter weinähnlichen Bedingungen zu überdauern und ist zudem ein wichtiger Faktor, der zur Kontamination von Weinen beiträgt. Dies sollte bei der Reinigung von Tanks oder Rohren berücksichtigt werden. Der Reinigungsprozess ist nach der Bildung eines Biofilms möglicherweise weniger effektiv, da ein Biofilm Zellen bessere Überlebenschancen unter stressigen Umweltbedingungen bietet. Darüber hinaus zeigten REM-Aufnahmen „Chlamydosporen-ähnliche“ Strukturen, die bisher für B. bruxellensis noch nicht beschrieben wurden. Chlamydosporen wurden bei einigen Pilzen als Resistenzformen beschrieben⁶, bei Hefen ist ihre Rolle jedoch unklar. Zukünftige Studien sollten sich auf die tatsächlichen Funktionen dieser „Chlamydosporen-ähnlichen“ Strukturen in B. bruxellensis konzentrieren, sowie deren Rolle in der Überdauerung dieser Schadhefe in Weinkellern.