O biofilme pode definir-se como uma comunidade de micro-organismos irreversivelmente unidos a uma superfície e entre si, incorporados numa matriz autoproduzida. Esta estratégia de crescimento, amplamente disseminada entre os micro-organismos, contribui para a sua persistência em vários ambientes, através de uma maior resistência ao stress e da colonização de superfícies¹. A capacidade de formar biofilmes da levedura responsável pela deterioração do vinho, a Brettanomyces bruxellensis, é insuficientemente descrita na literatura. A comprovação da aderência da B. bruxellensis à superfície dos equipamentos vinícolas e das suas capacidades de desenvolvimento de biofilmes possibilitaria o desenvolvimento de estratégias adequadas e eficientes para a sua remoção. Neste âmbito, o objetivo do presente trabalho consiste, em primeiro lugar, em evidenciar o estilo de vida dos biofilmes de B. bruxellensis; em segundo lugar, em visualizar as suas diversas estruturas celulares, por meio de observações microscópicas, e, em terceiro lugar, em estudar o impacto do vinho sobre os biofilmes estabelecidos produzidos por duas estirpes de B. bruxellensis.

Formação e estrutura dos biofilmes no vinho

As células das duas estirpes selecionadas (designadas por “11” e “14” e previamente isoladas a partir de equipamentos vinícolas) foram adaptadas às condições presentes no vinho tinto (teor alcoólico e pH), conforme descritas por Longin et al., 2016². Além disso, anteriormente à formação de biofilmes, assegurou-se, por meio de inóculos, que as células se encontrassem no mesmo estado fisiológico, correspondente ao final da fase de crescimento exponencial, possibilitando uma comparação exata da formação de biofilmes no vinho por diferentes estirpes. A formação de biofilmes no vinho pela B. bruxellensis foi estudada em aparas de aço inoxidável, através de um protocolo adaptado com base em estudos anteriores³. As aparas de aço inoxidável de 25&nbspmm&nbsp×&nbsp25&nbspmm foram imersas em 15&nbspml de vinho tinto, no qual foram inoculadas células com 5,0&nbsp×&nbsp10^5&nbspUFC/ml. Após a incubação, durante 7 e 14&nbspdias, a 28&nbsp°C, procedeu-se à lise celular por sonicação, as populações celulares cultiváveis presentes no biofilme foram determinadas por cultura em placa, num meio YPD, e a estrutura do biofilme foi observada por Microscopia Eletrónica de Varrimento (MEV).

A aderência e formação de biofilmes no vinho por ambas as estirpes foram monitorizadas na apara após 2h, 24h e 7 e 14&nbspdias de incubação, recorrendo ao protocolo anteriormente descrito. As culturas de levedura foram, inicialmente, inoculadas com cerca de 10^6&nbspUFC/ml (Tabela 1). Após 2 horas no vinho, a estirpe 14 apresentou uma fraca taxa de aderência, de 0,69&nbsp%, em comparação com a estirpe 11 (5,69&nbsp%). Esta diferença populacional manteve-se ao longo de 7 dias, mas não após 14 dias de incubação, ainda que não se tenha observado qualquer crescimento adicional do biofilme de nenhuma das estirpes inoculadas no vinho (Tabela&nbsp1). Este facto indicia a capacidade de aderência e formação de biofilmes em ambientes adversos, como o vinho, da B. bruxellensis, apesar de o crescimento do biofilme ser diminuto após 14 dias de incubação.

Paralelamente, as observações das estirpes 11 e 14, após 7 dias de incubação em aparas de aço inoxidável, revelaram a presença de microcolónias com células incorporadas em substâncias poliméricas extracelulares (SPE) (Figura 1A). Importa, além disso, ter em conta que foi observado um grande número de células filamentosas no interior das microcolónias, postulando-se a hipótese de as mesmas desempenharem um papel estrutural no biofilme (Figura 1A). As observações microscópicas demonstraram, igualmente, a presença de estruturas de maior dimensão do que uma célula normal de levedura, com paredes espessas e derivadas de células filamentosas (Figura 1B). Estas propriedades são características de estruturas semelhantes a clamidósporos, conforme anteriormente relatado no caso da C. albicans⁴.

Figura 1. A) Observações por MEV de microcolónias das estirpes 11 e 14 com 7 dias de idade, desenvolvidas em vinho tinto, em aparas de aço inoxidável. Foram efetuadas ampliações de 500x (desenvolvimento das microcolónias na superfície de aço inoxidável) e de 7000x (células filamentosas e SPE, respetivamente indicadas pelas setas brancas n.º 1 e 2). B) Observações por MEV de microcolónias da estirpe 14 com 14 dias de idade, desenvolvidas em vinho tinto, em aparas de aço inoxidável. Foram efetuadas ampliações de 7000x (estrutura semelhante a um clamidósporo, indicada por uma seta branca).

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Impacto do vinho sobre o biofilme da B. bruxellensis

Em primeiro lugar, foram produzidos biofilmes em aparas de aço inoxidável, num meio YPD (conforme anteriormente descrito) e, após 7 dias de incubação, as aparas com células aderentes a biofilmes foram transferidas para o vinho, de modo a estudar o respetivo impacto sobre os biofilmes de B. bruxellensis com 7 dias de idade. Foram enumerados dois tipos de células: (i) as que restavam no interior do biofilme das aparas e (ii) as que foram libertadas no vinho (Figura 2). No caso de ambas as estirpes, a quantidade de células no interior dos biofilmes diminuiu expressivamente após 24h, mas, posteriormente, permaneceu estável, até 14 dias (Figuras 2A e 2B). Conforme anteriormente descrito, o vinho teve um impacto mais negativo sobre a estirpe 14 do que sobre a estirpe 11. Acresce a observação de um fenómeno significativo de libertação de células pelo biofilme, decorridas apenas 2h da inoculação no vinho (com cerca de 10⁶&nbspUFC/ml), no caso de ambas as estirpes (Figuras 2A e 2B). Posteriormente, no caso da estirpe 14, registou-se um decréscimo do número de células libertadas durante 24 horas, antes de estabilizar durante, no máximo, 7 dias. A esta diminuição seguiu-se um aumento das contagens de células entre os dias 7 e 14. Observou-se o mesmo comportamento no caso da estirpe 11, embora em menor grau.

Figura 2. Comportamento das microcolónias no vinho, no caso (A) da estirpe 11 e (B) da estirpe 14. A população celular na apara é expressa em log10 (UFC/cm²) e a população celular libertada no vinho, em log10 (UFC/ml). As barras de erro representam o desvio-padrão entre três réplicas independentes. As diferentes letras indicam uma diferença significativa (ANOVA, valor de P ≤ 0,05).

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Conclusão

Neste estudo, demonstrou-se, no vinho, a capacidade da levedura deteriorante B. bruxellensis de formar um biofilme em aço inoxidável. Conforme descrito em relação a outros micro-organismos⁵, o estilo de vida do biofilme pode possibilitar a persistência da B. bruxellensis no vinho e em ambientes associados, para além de poder constituir uma importante via de contaminação do vinho. Este tipo de desenvolvimento deve ser tido em conta ao limpar cubas ou condutas, uma vez que, após a formação de um biofilme, o processo de limpeza pode tornar-se menos eficaz, dado que o estilo de vida do biofilme permite uma melhor resistência a condições de stress. Além disso, as observações por MEV revelaram estruturas “semelhantes a clamidósporos” que nunca tinham sido relatadas no caso da B. bruxellensis. Os clamidósporos foram descritos como formas de resistência em determinados fungos⁶, embora o papel que desempenham nas leveduras nunca tenha sido claramente identificado. Os futuros trabalhos de investigação dever-se-ão focar na determinação da sua verdadeira natureza e do papel efetivamente desempenhado por estas estruturas “semelhantes a clamidósporos” no caso da B. bruxellensis, bem como o seu contributo para a persistência da levedura deteriorante nas caves de vinhos.